一、实验课开设目的。
通过综合性实验要求学生掌握发酵的过程及发酵产物的分离提取的方法及一般步骤，增强学生的动手能力，培养工程素养。
二、实验课学时分配。
本课程总学时 36 ，其中讲课 27 ，综合性实验 6 。
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序号 |
实验题目 |
学时 |
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1 |
柠檬酸的发酵、提取及精制 |
6 |
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合计 |
6 |
三、实验课教材、参考数目
1、理论讲授教材
梁世中主编,生物工程设备,中国轻工出版社,2002年2月。
2、实验指导书
自编实验指导书
3、参考书
(1) 程丽娟 ,薛泉宏,微生物学实验技术,兴界图书出版公司,2000年4月。
(2) 贾世儒主编，生物工艺与工程试验技术，中国轻工业出版社，2002年9月。
四、实验内容及要求
实验 柠檬酸的发酵、提取及精制 (6学时)
柠檬酸的发酵
一、目的要求
了解利用黑曲霉生产柠檬酸的原理与流程，掌握柠檬酸的发酵生产方法。
二、基本原理
用于柠檬酸生产的原料有淀粉、废糖蜜等。本实验以糖为发酵原料，黑曲霉为产生菌。黑曲霉产柠檬酸多，耐酸力强。ph1.6～1.7时尚能生长。且酸 度大时产生葡萄糖酸、草酸等副产物较少，故进行柠檬酸发酵时，培养液以在pH2-3为宜。在一般发酵中，均产生多种酸，其中，低碳链的直链脂肪酸如甲酸、 乙酸等称为挥发酸，而乳酸、柠檬酸等称为非挥发酸。挥发酸和非挥发酸的总和称总酸。酸的测定方法常采用中和法、电位滴定法及比色法等。若待测液色泽很深， 可采用外指示剂法。本试验用中和法测定柠檬酸发酵中的总酸。柠檬酸的定性检验用Deniges试剂。
三、实验材料
1．菌种 黑曲霉斜面菌种3支。
2．器材 柠檬酸发酵培养液 硝酸铵2.0g，KH2P04 1.0g，MgS04 0.25g，蔗糖150g，lmol／L HCl 17ml，水1000ml。取100ml上述培养液，加入500ml三角瓶中，包扎灭菌。
Deniges试剂(HgO 1g溶于20ml 0.2L／L H2S04中)；0.1mol／L标准NaOH 0.1mol／L H2S04;酒精灯；滤纸，漏斗；烧杯：200ml，500ml；18X180试管；吸管10ml、5ml，150ml三角瓶；碱滴定管，铁台、蝴蝶夹：酚酞指示剂：200ml量筒；广泛pH试纸；玻璃棒；牛角勺；布氏漏斗，抽滤纸，抽滤水泵，离心机和离心管，滴管，天平。
四、实验步骤
1．接种 取柠檬酸发酵培养液3瓶，用接种环向每瓶接入黑曲霉孢子2～3环，25―28℃摇床培养5～7d。另1瓶不接种留作对照。
2．过滤 将3瓶培养液一并过滤，菌丝用蒸馏水略加洗涤后弃去。
3.定性检验 取过滤液和对照液各约5ml，放入试管内，加Deniges液lml，在酒精灯上缓缓加热至沸。逐滴加入20g／L KMn04溶液。若有柠檬酸存在，则出现白色沉淀。
4．酸度滴定 将过滤液充分摇匀，用吸管吸取10ml放入150ml三角瓶中，加2滴酚酞指示剂，用0.1mol／L NaOH滴定酸度。对照亦按同法滴定。二者消耗NaOH毫升数的差额乘以0.64，即得柠檬酸(g／L)的大约数。
柠檬酸的提取及精制
一、实验目的与要求
了解柠檬酸的发酵、树脂提纯及精制柠檬酸的方法，进一步学习并掌握离子交换法的操作过程。
二、实验主要内容
通过柠檬酸的发酵、树脂提纯及精制柠檬酸
三、实验仪器与试剂
1.实验所需仪器设备
三角瓶、酸式滴定管、烧杯、吸管、水浴锅、恒流泵、树脂交换柱、收集器、旋转蒸发仪、摇床、碱式滴定管、抽滤机
2.实验所需试剂（每班所需试剂量）
阴离子交换树脂2000g、阳离子交换树脂2000g、碳酸钙500g、硫酸500m1、黑曲霉斜面菌种3支、硝酸铵200g，KH2P04 200g，MgS04 250g，蔗糖2000g， HCl500ml
四、实验步骤
（1）树脂预处理
分别称取一定量的树脂(阳离子交换树脂和阴离子交换树脂)，清洗漂去杂质，放在交换柱中，先用1mol／LNaOH，后用水洗，再用1mol／L HCl，最后用水洗至pH≥4。每次所用溶液体积为树脂体积的3倍，流速的大小为柱截面积，两种树脂的预处理方法相同。
（2）柠檬酸提取
1）过滤
取发酵液2 L，趁热过滤，除掉菌丝体等不溶性杂质。取少量滤液，测定柠檬酸含量。
2) CaC03中和沉淀
柠檬酸与CaC03形成难溶的柠檬酸钙沉淀，CaC03的加量根据滤液中柠檬酸的总量,边搅拌边缓慢加入CaC03，以防止产生大量泡沫。CaC03加完后放置于85℃ 恒温水浴中加热，保温搅拌30min，趁热过滤，并用沸水洗涤柠檬酸钙沉淀，做柠檬酸钙的无糖检测(见后面的注意事项2)。
3）酸解
加入硫酸与柠檬酸钙反应，产生柠檬酸及硫酸钙沉淀， 将中和沉淀得到的沉淀物取出，称重，加入2倍量的水，调匀然后加热至85℃，加入硫酸。硫酸的加量应根据所加入的CaC03的量来计算。加完硫酸后，继续保温，搅拌30Min，趁热过滤，得清亮棕黄色的酸解液，取样测定含量。
4）树脂脱色
取已处理好的树脂100ml装入柱中，通入酸解液进行脱色，当出口pH≤3时，开始收集，流速为5ml／min，当出口pH>3时，脱色结束记录下收集液体，取样测定含量。
5）树脂脱金属离子
取已处理好的树脂150ml装入柱中，通入上述收集液，当出口≤3时，开始收集，流速为5ml／min，当出口pH>3时结束。在结束前用乙醇法检测终点，记下收集液总体积，取样测定含量。
6）真空浓缩
将收集液倒入浓缩器中，真空度为600～740mmHg(1mmHg=133.322Pa)，水浴温度为60℃，浓缩约10倍后，倒入小烧杯中。
7）结晶
将盛有浓缩液的小烧杯立即移至50℃恒温水浴中，搅拌结晶，以后控制水浴温度。每小时下降5℃，终了温度越低越好。结晶完毕后，抽滤，得到柠檬酸成品，称重。测定母液中柠檬酸含量，测定结晶品柠檬酸含量，计算柠檬酸的收率。
（3）注意事项：
1)柠檬酸含量测定 在一定量柠檬酸溶液中加入适量的去离子水，加入2-3滴酚酞指示剂，然后以0.1mol／L NaOH标准溶液滴定，记下体积v，柠檬酸总量按下式计算。
式中 vl――0.1mol／L NaOH标准溶液体积(m1)
c1――NaOH标准溶液浓度(mol／L)
v2――所取柠檬酸样品体积(m1)
Vo――柠檬酸溶液总体积(L)
2)柠檬酸钙中糖含量的检测 取柠檬酸钙的洗涤液20ml，加入一滴1％-2％高锰酸钾溶液，3min后溶液不变色，即说明糖分已洗除。
3)乙醇法检测离子交换终点 取离子交换液2ml，加入少量95％乙醇，摇匀，如发生浑浊，说明树脂已饱和，应立即停止交换。
五、实验报告要求
实验报告必须包括目的、原理、试验步骤和计算结果。